Aim
Testicular torsion is an emergency urological condition that can result in loss of the testis. Torsion causes ischemic injury; detorsion causes reperfusion injury. In our previous study, it was shown that exosomes derived from adipogenic mesenchymal stem cells (AMSCs) are effective in preventing testicular I-R damage in the experimental model. The aim is to examine the relationship of this effect with apoptosis-necroptosis pathways.
Methods
In this study, tissue sections from our previous study were used with ethical approval. (In our previous study, 21 prepubertal wistar albino male rats were divided into 3 groups of 7 each. Left orchiectomy was performed in the sham group without any procedure for the testicular parenchyma. Ischemia-Reperfusion model was created with torsion of the left testis at 720 degrees for 4 hours. Immediately after detorsion, 100µL of cell culture medium in the control group and 100µL of exosomes in the torsion treatment group was administered from 4 different points of the testicular parenchyma. Left orchiectomy was performed after 4 hours of reperfusion.) In our study, apoptotic and necroptotic pathways were evaluated using the indirect immunoperoxidase method using caspase3-8-9, Bcl2, RIPK1-3 (Receptor interacting protein kinase1-3), MLKL (mixed lineage kinase domain like) antibodies on sections obtained from the previous experiment. Immunoreactivity intensities were calculated by H scores (The formula ∑Pi (I+1) was used. I:Staining intensity, Pi:The percentage of cells stained for each intensity). Data were evaluated with the Kruskal-Wallis test. p<0.05 values were considered significant.
Results
Caspase3-8-9 H-scores were lower in the treatment group than in the control group (p>0.05). The H-score of Bcl2 was calculated as 102 in the treatment group and 134,42 in the control group (p<0,05). MLKL and RIPK1 values were lower in the treatment group and the difference between treatment and control groups are significant. The H-scores of RIPK3 were 130.66 in the treatment group and 171.80 in the control group (p>0.05).
Conclusions
Induction of cell death in the experimental testicular I-R model shows that necroptosis is also triggered along with apoptosis. Exosome treatment originating from AMSCs also seems to affect certain steps on both the apoptotic and the necroptotic pathway.
Keywords: Testis, torsion, ischemia-reperfusion, exosome, apoptosis, necroptosis
Amaç
Testis torsiyonu, testisin kaybı ile sonuçlanabilen acil ürolojik bir durumdur. Torsiyon, iskemik hasara; detorsiyon reperfüzyon hasarına neden olmaktadır. Önceki çalışmamızda deneysel testis iskemi-reperfüzyon (İ-R) modelinde adipojenik mezenşimal kök hücre (AMKH) kaynaklı eksozomların testisin İ-R hasarını önlemede etkili olduğu gösterilmişti. Bu çalışmanın amacı, aynı modelde eksozomların oluşturduğu bu etkinin, apoptozis ve nektroptozis yolakları ile ilişkisini incelemektir.
Yöntem
Çalışmada önceki çalışmamıza ait doku kesitleri, etik onay alınarak kullanıldı. (Önceki çalışmamızda 21 adet prepubertal wistar albino cinsi erkek sıçan, sham, kontrol ve tedavi grubu olmak üzere 7’şerli 3 gruba ayrıldı. İskemi-Reperfüzyon modeli; sol testisin 4 saat 720 derece torsiyonu ardından detorsiyon sonrası 4 saat reperfüzyona bırakılması ile oluşturuldu. Sham grubunda testis parankimine yönelik işlem yapılmadan sol orşiektomi uygulandı. Detorsiyondan hemen sonra testis parankiminin 4 ayrı noktasından kontrol grubunda 100µL hücre kültür vasatı; tedavi grubunda 100µL AMKH elde edilen eksozom uygulandı. 4 saatlik reperfüzyon sonrası sol orşiektomi uygulandı). Çalışmamızda önceki deneyden elde edilen kesitlere, İndirekt immünoperoksidaz yöntemi ile kaspaz 3-8-9, Bcl2, RIPK1-3 (Receptor interacting protein kinase 1-3), MLKL (mixed lineage kinase domain like) antikorları kullanılarak apoptotik ve nekroptotik yolak değerlendirildi. Immunoreaktivite yoğunlukları H skorları ile hesaplandı (H skoru için ∑Pi (I+1) formülü kullanıldı. I: boyanma yoğunluğunu, Pi ise her yoğunluk için boyanan hücre yüzdesi). Veriler Kruskal-Wallis testi ile değerlendirildi. p<0,05 değerler anlamlı kabul edildi.
Bulgular
Kaspaz 3-8-9’un H-skorları, tedavi grubunda kontrol grubuna göre daha düşüktü (p>0,05). Bcl2’nin H-skoru ise tedavi grubunda 102, kontrol grubunda 134,42 olarak hesaplandı (p<0,05). MLKL’nin H-skoru, tedavi grubunda 194,33 kontrol grubunda 386,47 idi (p<0,05). RIPK1’in H-skoru ise kontrol grubunda 381,85, tedavi grubunda 315 saptandı (p<0,05). RIPK3’in H-skorları ise tedavi grubunda 130366, kontrol grubunda da 171,80 olarak belirlendi (p>0,05).
Sonuç
Deneysel testis İ/R modelinde hücre ölümünün tetiklenmesi, apoptozis ile birlikte nekroptozisin de tetiklendiğini göstermektedir. AMKH kaynaklı eksozom tedavisi de hem apoptotik yolak hem de nekroptotik yolak üzerindeki belli basamakları etkiliyor gibi görünmektedir.
Anahtar Kelimeler: Testis, torsiyon, iskemi-reperfüzyon, eksozom, apoptozis, nekroptozis