Investigation of the effects and mechanisms of sucralfate on intestinal epithelial cells in an in-vitro necrotizing enterocolitis model.

A Şencan*, HS Vatansever**

*Manisa Celal Bayar University Medical School Department of Pediatric Surgery, Manisa, Turkey
**Manisa Celal Bayar University, Medical School, Department of Histology-Embryology, Manisa

Aim: Sucralfate is a cytoprotective drug that supports the mucosal barrier. The study aimed to investigate the effect and mechanisms of sucralfate on enterocytes in the in-vitro necrotizing enterocolitis (NEC) model.

Methods: 5 experimental groups were formed by culturing the intestinal epithelial cell (IEC-6) line. Lipopolysaccharide was used for NEC induction. The development of the NEC model was confirmed by measuring TNF-α and IL-8 levels. After sucralfate application, cell viability test was performed, and the application dose was determined. No treatment was applied to IEC-6 cells in the control group. The IEC-6 cell line was incubated with sucralfate in the sham group and with Lipopolysaccharide in the NEC group for 48 hours. The treatment group (TG) received 48 hours of sucralfate after 48 hours of Lipopolysaccharide. In the prophylaxis group (PG), 48 hours of Lipopolysaccharide was applied after 48 hours of sucralfate. After the procedure, immunohistochemical staining was performed. H scores of caspase-3-8-9, RIPK1, RIPK3, MLKL, occludin, claudin, ICAM-1, MadCAM-1were calculated. The groups were compared with the one-way-ANOVA test.

Results: TNF-α and IL-8 levels were higher in the NEC group. The non-toxic dose of sucralfate was determined as 106μL/cm2 at 2:1 dilution. TUNEL positive cells were detected 65.6%±8.2% in the NEC group, 15.4±3.2% in the TG, 23.4±4.2% in the PG (p<0.05). H scores of Caspase3 were similar in all groups. Caspase8-9 and RIPK1 were higher in NEC group. The RIPK3 level was lower in the NEC group compared to the TG and PG. MLKL expression was higher in the NEC group, and lower in the TG and PG (p<0.05). ICAM-1 expression didn't differ significantly between the groups. MadCAM-1 was higher in the NEC group. Sucralfate decreased MadCAM-1 expression in both PG and TG. Occludin expression was high and claudin expression was lower in the TG.

Conclusions: In the experimental NEC model, apoptosis and necroptosis increase and the expression of cell adhesion molecules changes. Sucralfate suppresses apoptosis and necroptosis and helps protect cell adhesion molecules. Prophylactic administration of sucralfate doesn’t appear to be as effective as therapeutic administration.

Keywords: Necrotizing enterocolitis, sucralfate, cell culture, apoptosis, necroptosis, cell adhesion molecules

İn-vitro nekrotizan enterokolit modelinde sukralfatın intestinal epitel hücrelerine etkisi ve mekanizmalarının araştırılması

A Şencan*, HS Vatansever**

*Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Cerrahisi Anabilim Dalı, Manisa
**Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji - Embriyoloji Anabilim Dalı

Amaç: Sukralfat mukozal bariyeri destekleyen sitoprotektif bir ilaçtır. Çalışma, İn-vitro nekrotizan enterokolit (NEK) modelinde sukralfatın enterositler üzerindeki etkisini ve mekanizmalarını araştırmayı amaçlamıştır.

Yöntem: İntestinal epitel hücre (IEC-6) hattı kültüre edilerek 5 deney (kontrol, sham, NEK, tedavi ve profilaksi) grubu oluşturuldu. NEK indüksiyonu için lipopolisakkarit (LPS) kullanıldı. NEK modelinin geliştiği TNF-α ve IL-8 düzeyleri ölçülerek (ELISA yöntemi) doğrulandı. Sukralfat uygulama sonrası hücre canlılık testi (MTT testi) yapılarak uygulama dozu belirlendi. Kontrol grubunda IEC-6 hücrelerine herhangi bir işlem yapılmadı. IEC-6 hücre hattı sham grubunda sukralfat ile, NEK grubunda ise LPS ile 48 saat enkübe edildi. Tedavi grubuna önce 48 saat LPS ile, sonrasında da 48 saat sukralfat ile enkübsyon yapıldı. Profilaksi grubuna ise önce 48 saat sukralfat, sonrasında 48 saat LPS ile enkübasyon uygulandı. İşlem sonrası immunohistokimyasal boyama yapıldı. Apoptozis yolakları (kaspaz-3-8-9), nekroptozis yolakları (RIPK1, RIPK3, MLKL) ve hücre adhezyon molekülleri (okludin, klaudin, ICAM-1, MadCAM-1) değerlendirilerek H skorları hesaplandı. Gruplar arasındaki farklar one way-ANOVA testi ile karşılaştırıldı. p<0.05 değerler anlamlı kabul edildi.

Bulgular: NEK grubunda TNF-α ve IL-8 düzeyleri kontrol grubuna göre yüksekti (p<0.05), Sukralfatın toksik olmayan dozu 2:1 dilüsyonda 106μL/cm² olarak belirlendi. TUNEL pozitif hücreler NEK grubunda %65,6±8,2, tedavi grubunda %15,4±3,2, profilaksi grubunda ise 23,4±4,2 saptandı (p<0.05). Tüm gruplarda Kaspaz3’ün H skorları benzerdi. Kaspaz8-9 ve RIPK1 ise NEK grubunda yüksekti (p<0.05). NEK grubunda RIPK3 düzeyi, tedavi ve profilaksi grupları ile kıyaslandığında daha düşüktü (p<0.05). MLKL ekspresyonu NEK grubunda, kontrol grubuna göre yüksek, tedavi ve profilaksi gruplarına göre ise düşüktü (p<0.05). ICAM-1 ekspresyonu gruplar arasında anlamlı farklılık oluşturmadı. MadCAM-1, NEK grubunda kontrol grubuna göre yüksekti. Sukralfat hem profilaksi hem de tedavi gruplarında MadCAM-1 ekspresyonunu düşürdü (p<0.05). Tedavi grubunda okludin ekspresyonu yüksek, klaudin ekspresyonu ise daha düşüktü (p<0.05).

Sonuç: İn-vitro NEK modelinde apoptosis ve nekroptozis artar, hücre adhezyon moleküllerinin ekspresyonu değişir. Sukralfat, apoptozis ve nekroptozisi baskılar, hücre adhezyon moleküllerinin korunmasına yardımcı olur. Sukralfatın profilaktik uygulanması, tedavi amaçlı verilmesi kadar etkili gözükmemektedir.

Anahtar Kelimeler: Nekrotizan enterokolit, sukralfat, hücre kültürü, apoptosis, nekroptosis, hücre adhezyon molekülleri