Objective: In this study, it is aimed to present the construction stages of a three-layer hybrid tissue engineering product containing an epithelium and two layers of muscle cells developed for esophageal replacement.
Method: The esophagus model was planned as a layered hybrid structure formed with a three-layer scaffold. To obtain epithelial cells, the oral mucosa of New Zealand rabbits was surgically excised as a strip, and characterization was performed by propagating in cell culture. Epithelial cells in the innermost layer, muscle cells in the second layer, and the scaffold dynamically grown in the bioreactor and the scaffold in which muscle and stem cells are grown in the outermost layer were prepared to form a three-layer structure. In order to produce tissue scaffolds, polycaprolactone (PCL) scaffolds in disperse and oriented fiber structure were produced by electrospinning technique using PCL material, dispersed scaffolds in the lower and upper layers and longitudinally oriented scaffolds in the middle layer were used. To provide nerve innervation from the umbilical cord of newborn rabbits, Wharton gel was surgically removed and pre-implantation mesenchymal stem cells were isolated and placed in the top layer of the three-layer hybrid structure.
Results: Dynamic Mechanical Analysis (DMA) mechanical strength of PCL scaffold produced using electrospinning technique is higher than natural esophageal tissue. Characterization of oral mucosa epithelial cells seeded on PCL scaffold with epithelial cells-associated proteins pancytokeratin and p63, muscle cells-associated α-SMA and desmin was performed by immunofluorescence staining. The neural differentiation potentials of mesenchymal stem cells isolated from Wharton's jelly seeded on the PCL scaffold outer layer were demonstrated by immunofluorescence staining of the neural differentiation-related proteins β-III tubulin, O4 and GFAP after 21 days of in vitro culture.
Conclusion: Esophageal model hybrid tissue engineering product has been developed that can be used effectively for esophageal replacement in esophageal defects.
Keywords:
Amaç: Bu çalışmada özofagus replasmanı amacıyla geliştirilen bir kat epitel ve iki kat kas hücresi içeren üç katmanlı hibrit doku mühendisliği ürününün yapım aşamalarının sunulması amaçlanmıştır.
Yöntem: Özofagus modeli üç kat iskele ile oluşturulan katmanlı hibrit yapı olarak planlandı. Epitel hücrelerinin elde edilmesi için Yeni Zelanda ırkı tavşanların oral mukozası şerit şeklinde cerrahi olarak eksize edilmiş, hücre kültüründe çoğaltılarak karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Ticari olarak sağlanan kas hücrelerinin kültivasyonu yapılarak karakterize edilmiştir. En iç katmanda epitel hücreleri ekilmiş iskele, ikinci katmanda kas hücreleri ekilmiş ve biyoreaktörde dinamik olarak kültive edilmiş iskele, en dış katmanda ise kas ve kök hücre ekilmiş iskele üç katmanlı yapıyı oluşturacak şekilde hazırlanmıştır. Doku iskelesi üretilmesi amacıyla polikaprolakton (PCL) materyal kullanılarak elektroeğirme tekniği ile dağınık ve yönlendirilmiş fiber yapıda PCL iskeleler üretilmiş, en alt ve en üst katmanda dağınık, orta katmanda uzunlamasına yönlendirilmiş iskeleler kullanılmıştır. Sinir innervasyonunu sağlamak amacıyla yeni doğum yapmış tavşanların göbek kordonu Wharton jeli cerrahi olarak alınarak mezenkimal kök hücreler izole edilmiş ve üç katmanlı hibrit yapının en üst katmanına implantasyon öncesi ekilmiştir.
Bulgular: Elektroeğirme tekniği kullanılarak üretilen PCL iskelenin Dinamik Mekanik Analiz (DMA) sonucunda en yüksek çekme mukavemeti 2,806 MPa ve uzama değeri ise %157 bulunmuştur. Bu değerler, çekme mukavemeti 0,571 MPa ve uzama değeri %72 olan native özofagus dokudan daha yüksektir. PCL iskele üzerine ekimi yapılmış oral mukoza epitel hücrelerinin karakterizasyonu epitel-ilişkili proteinler olan pansitokeratin (CK) ve p63, kas hücrelerinin karakterizasyonu α-SMA ve desmin immunofloresan boyamalarıyla gerçekleştirilmiştir. PCL iskele dış katmana ekimi yapılmış olan Wharton jelinden izole edilen mezenkimal kök hücreler (WJMKH)’in nöral farklılaşma potansiyelleri 21 gün in vitro kültür sonrasında nöral farklılaşmaya ilişkili proteinler olan β-III tubulin, O4 ve GFAP immunofloresan boyamalarıyla gösterilmiştir.
Sonuç: Özofageal defektlerde özofagus replasmanı amaçlı kullanımı etkin olarak yapılabilecek özofagus modeli hibrit doku mühendisliği ürünü geliştirilmiştir.
Anahtar Kelimeler: